液相色譜法測(cè)定健骨膠囊中淫羊藿苷的含量實(shí)驗(yàn)

一、摘要
1、目的：建立用液相色譜法測(cè)定健骨膠囊中淫羊藿苷含量的方法。
2、方法：LichrospherC18 色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相甲醇-1.5%冰乙酸水溶液（55：45）；檢測(cè)波長：270nm；流速1.0ml/min；柱溫30℃。
3、結(jié)果：該方法淫羊藿苷回收率為99.28% RSD2.52%。結(jié)論：該方法簡便、快速、靈敏度高，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 
      健骨膠囊由淫羊藿、補(bǔ)骨脂等藥材組成。用于肝腎不足所致骨質(zhì)疏松癥。淫羊藿為本方君藥，主要含黃酮、木脂素、生物堿和多糖，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要有效物質(zhì)之一。故選擇淫羊藿苷為指標(biāo)測(cè)定淫羊藿的含量。由于方中藥味較多，其他方法難于測(cè)定其含量，故本文采用液相色譜法測(cè)定健骨膠囊中淫羊藿苷的含量，該含量測(cè)定方法是在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上結(jié)合本制劑的特點(diǎn)進(jìn)行方法學(xué)考察而確立的。
  
二、儀器與試藥
    戴安液相色譜儀，UVD340U二極管陣列檢測(cè)器，ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器，戴安色譜工作站，色譜柱：LichrospherC18 柱（5μm，150mm×4.6mm）；甲醇為色譜純，水為重蒸水。淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)111640-200401）由中國藥品生物制品檢定所提供。健骨膠囊，淫羊藿陰性膠囊由哈爾濱商業(yè)大學(xué)制劑室自制。
  
三、方法與結(jié)果

1、色譜條件
   色譜柱：LichrospherC18 柱（5μm，150mm×4.6mm）；流動(dòng)相：甲醇-1.5%冰乙酸水溶液（55：45）；檢測(cè)波長：270nm；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃。分離度（R）：大于1.5；色譜柱的理論塔板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2500。
2、對(duì)照品溶液的制備
   精密稱取經(jīng)干燥至恒重的淫羊藿苷對(duì)照品，加甲醇溶解制成1.31mg/ml的對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液5μl，注入液相色譜儀。
3、供試品溶液的制備
   取干燥至恒重的健骨膠囊內(nèi)容物1g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過。取續(xù)濾液，即得。精密吸取供試品溶液5μl，注入液相色譜儀。   
4、陰性供試液的考察
   取淫羊藿陰性膠囊內(nèi)容物1g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，按2.3供試品溶液的制備項(xiàng)下方法操作。陰性樣品在與對(duì)照品和供試品相對(duì)應(yīng)的位置上無吸收峰。結(jié)果表明陰性供試液對(duì)樣品溶液的測(cè)試無干擾。該法的專屬性良好。
5、檢測(cè)波長的選擇
   取淫羊藿苷對(duì)照品溶液（3.64μg/ml），在230～500nm處進(jìn)行掃描，結(jié)果在269.8nm波長處有zui大吸收，選定270nm做測(cè)定波長。
6、線性范圍
   精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品13.1mg，置10ml容量瓶中，加甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。制成1.31mg/ml淫羊藿苷甲醇溶液。精密量取以上對(duì)照品溶液：0.4ml、0.8ml、1.2ml、1.6ml、2.0ml分別置于2ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，質(zhì)量濃度分別為0.262、0.524、0.786、1.048、1.310mg/ml的對(duì)照品溶液。各精密量取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積。以峰面積值（A）對(duì)濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，A=168.523C-2.982 r=0.9996，并以峰面積值A(chǔ)對(duì)濃度C作圖，得一直線。以上結(jié)果表明，在0.262mg/ml～1.310mg/ml范圍內(nèi)，進(jìn)樣濃度與峰面積值有良好的線性關(guān)系。
7、精密度實(shí)驗(yàn)
   精密量取淫羊藿苷對(duì)照品溶液（1.31mg/ml）20μl注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，試驗(yàn)表明：該法的精密度良好。
8、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
   精密吸取同一供試品（批號(hào)050407）溶液，分別于0、2、4、6、8、12小時(shí)進(jìn)樣，依法測(cè)定，結(jié)果表明，供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
9、 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)
    按3供試品溶液的制備方法，對(duì)同一批樣品（批號(hào)050407）6份進(jìn)行測(cè)定，求得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.50%。　
10、加樣回收率實(shí)驗(yàn)
    分別取六份健骨膠囊內(nèi)容物各0.5g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，精密稱定，分別加入一定濃度的淫羊藿苷對(duì)照品溶液，水浴蒸干，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，即得。各精密量取5μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果表明，該法的準(zhǔn)確度較好。
11、檢測(cè)限和定量限的測(cè)定
    為保證含量測(cè)定的準(zhǔn)確，須確定供試品中被測(cè)物能被檢測(cè)出的zui低量和被定量測(cè)定的zui低量。采用信躁比法，當(dāng)淫羊藿苷濃度為26.2μg/ml時(shí)，信躁比為3∶1，則淫羊藿苷的檢測(cè)限為26.2μg/ml；當(dāng)淫羊藿苷濃度為39.3μg/ml時(shí)，信躁比為10∶1，則淫羊藿苷的定量限為39.3μg/ml。
12、耐用性試驗(yàn)
    考察流動(dòng)相比例、流速的變動(dòng)，對(duì)分離度等結(jié)果的影響。
    結(jié)論：在測(cè)定條件下，系統(tǒng)的輕微變動(dòng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響不大，系統(tǒng)耐用性良好。
13、含量測(cè)定
    取健骨膠囊內(nèi)容物1g，研細(xì)，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，稱定重量，超聲處理1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10ml，并轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，即得。另取淫羊藿苷對(duì)照品，用甲醇制成每1ml中含淫羊藿苷1.31mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品溶液與對(duì)照品溶液各5μl分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，測(cè)定結(jié)果表明10批次的制劑質(zhì)量穩(wěn)定。

四、討論
    分別選用不同提取溶劑甲醇、氯仿、乙酸乙酯對(duì)健骨膠囊進(jìn)行提取，測(cè)定。結(jié)果差別明顯，氯仿、乙酸乙酯的提取量較低，用甲醇提取比較*。通過對(duì)供試液制備中提取時(shí)間的考察，結(jié)果顯示提取時(shí)間為60、80分鐘時(shí)，淫羊藿含量zui高，且無明顯差異，提取40分鐘淫羊藿苷含量較低，提取不充分，zui終確定提取時(shí)間為60分鐘。
    該方法簡便、快速、靈敏度高，可用于該產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

相關(guān)產(chǎn)品資料：Hypersil,Kromasil,廣州氣相色譜儀,色譜標(biāo)準(zhǔn)品,inertsil